Condiciones Generales

La investigación se realizó en el cuarto de crecimiento del departamento de Fisiología Vegetal y Bioquímica perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), con una temperatura de 26/18 °C (día/noche) y un fotoperíodo de 12 horas luz y 12 horas de oscuridad, en el período comprendido de marzo a abril de 2018.

El cultivo utilizado fue el garbanzo (Cicer arietinum L.), cv. ‘Nacional-29’, que se nombrará de forma abreviada como ‘N-29’ y se caracteriza por presentar un porte acamado, hojas imparipinnadas, con 35 días a la floración y los días a la cosecha oscilan entre 115 y 130 (Shagarodsky et al., 2021Shagarodsky, T.; Veitia, M. y Cabrera, M. (2021). Manual para el manejo y producción sostenible del cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.) en Cuba, 67 pp. ISBN 978-959-7223-32-0
).

Las semillas se trataron previamente con Hipoclorito de sodio al 1 % durante diez minutos y luego se lavaron cinco veces con agua destilada estéril. Seguidamente, se pusieron a pregerminar en placas Petri a temperatura ambiente durante cuatro días, hasta la emisión de la radícula y la plúmula. La siembra de las semillas pregerminadas se realizó en recipientes plásticos de 700 g de capacidad que contenían suelo Fluvisol agrogénico eútrico medianamente profundo, medianamente humificado (Hernández et al., 2015Hernández, J. A., Bosh, I. D., Pérez, J. J. M., Castro, S. N., (2015). Clasificación de los suelos de Cuba. Ediciones INCA, Cuba. ISBN: 978-959-7023-77-7
) y materia orgánica de origen animal (estiércol vacuno) a razón de 2:1 (v:v).

Los tratamientos se distribuyeron en un diseño completamente aleatorizado con arreglo bifactorial (4x3). Los factores estudiados fueron los niveles de salinidad (Factor I): 25, 50 y 75 mM de NaCl y un control. El otro lo constituyeron las cepas de HMA (Factor II): control (sin NaCl), INCAM 4 de Glomus cubense (Rodríguez et al., 2011Rodríguez, Y.; Dalpé, Y.; Séguin, S.; Fernández, K.; Fernández, F. y Rivera, R. A. (2011). Glomus cubense sp. nov., an arbuscular mycorrhizal fungus from Cuba. Mycotaxon, 118, 337-347. https://doi.org/10.5248/118.337
) e INCAM 11 de Rhizophagus irregularis (Sieverding et al., 2014Sieverding, E.; da Silva, G. A.; Berndt, R. y Oehl, F. (2014). Rhizoglomus, a new genus of the Glomeraceae. Mycotaxon. Volume 129(2), pp. 373–386. https://doi.org/10.5248/129.373
). Se emplearon 12 tratamientos descritos en la Tabla I, donde cada uno tuvo un total de 40 plantas, a razón de una planta por maceta. El título del inóculo de HMA fue de 45 esporas/g y se colocaron 2 g por nicho a la hora del trasplante.

La salinidad fue inducida dos veces por semana, a partir de los 15 días de la siembra de la semilla pregerminada. Para ello, se añadió 50 ml de solución salina a las plantas sembradas según los tratamientos que contenían sal y para los controles se aplicó la misma cantidad de agua y frecuencia. Se evaluaron 6 plantas por cada tratamiento para un total de 72 plantas.

Variables evaluadas

Se estudiaron diferentes variables relacionadas con el crecimiento: estimación del contenido de clorofilas para lo que se empleó un medidor portátil SPAD, expresado en unidades SPAD (Soil Plant Analysis Development), la biomasa total (g) y se calculó la relación área foliar y el área foliar específica de acuerdo con Beadle (1993)Beadle, C. (1993). Growth analysis. In: Hall, D.O.; Scurlock, J.M.O.; Bolharnordenkampfh, R.; Leegood, R.C. y Long, S.P. (Eds.), Photosynthesis and Production in Changing Environment. A Field and Laboratory Manual, Chapman and Hall, London: 36-46. Disponible en: http://www.springer.com/gp/book/97804124290.
.

La relación de área foliar (RAF), que refleja el tamaño de la superficie fotosintética con relación a la masa respiratoria, se calculó mediante la expresión: RAF = RPF x AFE; en la que la relación de peso foliar (RPF), expresa la fracción de la biomasa total invertida en las hojas y el área foliar específica (AFE) es la relación entre el área y el peso foliar, los cuales se calculan mediante las siguientes expresiones: RPF = [(MF2-MF1) / (M2 - M1)] [(ln M2/M1) / (ln MF2/MF1)] y AFE = [(SF2-SF1) /(MF2-MF1)] [(ln MF2/MF1) /(ln SF2/SF1)], donde MF1 y MF2 son los pesos secos foliares al inicio y al final del período considerado y SF₂ y SF₁ la superficie total foliar inicial y final, respectivamente.

Además, se determinaron variables micorrízicas como la colonización de la raíz, intensidad (Trouvelot et al., 1986Trouvelot, A.; Kough, J.L. y Gianinazzi-Pearson, V. (1986). Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In: Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae, V. Gianinazzi-Pearson and S. Gianinazzi (eds.). INRA Press, Paris, pp. 217-221.
) y número de esporas de HMA en el suelo (Herrera-Peraza et al., 2004Herrera-Peraza, R. A.; Furrazola, E.; Ferrer, R. L.; Valle, R. F. y Arias, Y. T. (2004). Functional strategies of root hairs and arbuscular mycorrhizae in an evergreen tropical forest, Sierra del Rosario, Cuba. Revista CENIC Ciencias Biológicas, 35, 12.
).

Procedimiento estadístico

Se comprobó la normalidad y homogeneidad de las varianzas, según las pruebas de Kolmogorov-Smirnov, Cochran, Hartley y Bartlett. Posteriormente, se realizó un Análisis Factorial para determinar la interacción entre los factores (4x3), en caso de encontrar interacción se analizaron las mismas mediante la Prueba de Comparación de Rangos Múltiples de Duncan, referido por Cochran y Cox (1990)Cochran, W. y Cox, G. (1990). Diseños experimentales. México Editorial Trellas. 132,135.
con p ≤ 0,05%, utilizando el programa estadístico IBM.SPSS.Statistics versión 22. Para la elaboración de los gráficos se utilizó el paquete estadístico SigmaPlot versión 11.0.

Variables de crecimiento y desarrollo

La salinidad inhibe severamente el crecimiento y desarrollo de las plantas. El efecto de la inoculación de los HMA en el contenido relativo de clorofila en el cultivo del garbanzo bajo el efecto de estrés salino se muestra en la Figura 1.

El contenido relativo de clorofila, disminuyó significativamente con el incremento de la salinidad. Las plantas de los tratamientos controles y las crecidas con 25 mM de NaCl mostraron valores similares para cada condición de inoculación. También, de manera distintiva, las plantas inoculadas con G. cubense manifestaron valores estadísticamente superiores a los controles, pero inferiores a las inoculadas con R. irregularis. A 75 mM de NaCl se observó un decremento de esta variable, con valores superiores en el tratamiento con R. irregularis.

Los resultados mostraron que la inoculación con R. irregularis aumentó el contenido de clorofila de las hojas cuando se compara con las plantas inoculadas con G. cubense y las controles. Sin embargo, en las hojas de las plantas sin micorrizar es más marcado el efecto, ya que se redujo significativamente el contenido clorofílico (P ≤0.05) al aumentar la concentración de NaCl.

Parvin et al. (2020)Parvin, S.; Van- Geel, M.; Yeasmin, T.; Verbruggen E. y Honnay. O. (2020). Effects of single and multiple species inocula of arbuscular mycorrhizal fungi on the salinity tolerance of a Bangladeshi rice (Oryza sativa L.) cultivar. Mycorrhiza (2020) 30:431–444. https://doi.org/10.1007/s00572-020-00957-9
informaron un incremento del contenido de clorofilas en plantas de arroz (O. sativa) inoculadas con tres cepas de HMA, así como un decremento significativo de esta variable a medida que aumentaban las concentraciones salinas.

Esta disminución en la concentración de clorofila en plantas controles respecto a las micorrizadas puede estar relacionada con la senescencia observada en las hojas debido al estrés por NaCl, lo que ha sido relacionado con la acumulación de iones tóxicos (Na⁺ y Cl^-) o el agotamiento del K⁺ y el Ca²⁺ (Evelin et al., 2019Evelin, H.; Devi, T.S.; Gupta, S. y Kapoor, R. (2019). Mitigation of salinity stress in plants by arbuscular mycorrhizal symbiosis: Current Understanding and New Challenges. Front. Plant Sci. 10:470. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00470.
). En el garbanzo también se ha observado esta respuesta con diferentes niveles de salinidad (Navid, 2015Navid B., (2015). Agronomic effectiveness of mycorrhizal Cicer arietinum L. plants on mechanism of proline in imparting protection, against NaCl stress. Adv. Environ. Biol., 9(3), 286-298. ISSN-1995-0756
; Garg y Bharti, 2018Garg, N. y Bharti, A. (2018). Salicylic acid improves arbuscular mycorrhizal symbiosis, and chickpea growth and yield by modulating carbohydrate metabolism under salt stress. Mycorrhiza 28, 727–746. https://doi.org/10.1007/s00572-018-0856-6
).

Se analizó además la efectividad de la inoculación micorrízica sobre algunos indicadores de crecimiento de la planta (la relación área foliar, área foliar específica y la biomasa total) expuestas a diferentes concentraciones salinas (Tabla 2).

Estos resultados arrojaron que el cultivo del garbanzo cuando se inocula con R. irregularis y G. cubense, logra mayores valores de superficie foliar que las plantas no inoculadas. Por otra parte, las plantas estresadas y micorrizadas con G. cubense, alcanzaron menor tamaño de la superficie foliar, con respecto, a los tratamientos estresados e inoculados con R. irregularis; sin embargo, sus valores fueron superiores a los tratamientos que no recibieron inoculación.

Las plantas crecidas a una concentración salina de 50 Mm de NaCl e inoculadas con R. irregularis, mostraron resultados similares a los tratamientos control y a los no salinos micorrizados. Los valores más bajos de la relación área foliar se encontraron en las plantas no inoculadas en todas las concentraciones salinas impuestas, excepto aquellas plantas en tratamiento control. Las plantas estresadas sin inoculación, mostraron mayor número de hojas secas, amarillas y necróticas, trayendo consigo menor número de hojas totales, disminución en la actividad fotosintética y por ende menos superficie foliar.

En cuanto al área foliar específica no se apreció ningún efecto beneficioso por la micorrización ante las condiciones salinas impuestas, pues en este indicador no se muestran diferencias entre los tratamientos salinos y no salinos, inoculados y no inoculados.

Una reducción del AFE se atribuye a una alteración en la estructura de la hoja, o bien al incremento en la concentración de nutrimentos o carbohidratos no estructurales en la misma (Newton, 1991Newton, P.C.D. (1991). Direct effects of increasing carbon dioxide on pasture plants and communities. N.Z. J Agricultural Research: (34):124. https://doi.org/10.1080/0028823.1991.10417789
); tal reducción, es el resultado de una incapacidad de la planta, para asignar estos compuestos en crecimiento estructural (Baxter et al., 1994Baxter, R.; Ashenden, T.W.; Sparks, T.H. y Farrar, J.F. (1994). Effects of elevated carbon dioxide on three montane grass species. I. Growth and dry matter partitioning. Journal Experimental Botanic (45):305-315. https://doi.org/10.1093/jxb/45.9.1267
).

Se describe la biomasa total que resume el comportamiento de esta variable en los órganos de la planta. Los resultados confirman lo planteado anteriormente: 1) una disminución de esta variable tanto en las plantas controles como en las inoculadas con ambas cepas de HMA, de acuerdo al aumento de la concentración salina a partir de los 50 mM de NaCl; 2) el mejor comportamiento de los tratamientos con R. irregularis con valores significativamente mayores que los del tratamiento control sin sal; 3) la notable reducción de biomasa en los tratamientos a 75 mM de NaCl. Además, no se observaron diferencias significativas entre las plantas controles y las inoculadas con la cepa INCAM 4 (G. cubense) a las diferentes concentraciones de sal en estudio.

En las plantas de garbanzo crecidas en diferentes concentraciones salinas, similares a este estudio, se encontró que la biomasa de los órganos fue significativamente menor en las plantas estresadas sin inoculación con respecto a las plantas estresadas e inoculadas. Por su parte, Navid (2015)Navid B., (2015). Agronomic effectiveness of mycorrhizal Cicer arietinum L. plants on mechanism of proline in imparting protection, against NaCl stress. Adv. Environ. Biol., 9(3), 286-298. ISSN-1995-0756
informó que la salinidad disminuyó significativamente la producción de biomasa en hojas y raíces de plantas de garbanzo, tanto en genotipos susceptibles como tolerantes, sin embargo, este efecto pudo revertirse con la inoculación micorrízica, siendo superior este resultado en las plantas estresadas inoculadas.

En estudios realizados por Bharti y Garg, (2019)Bharti, A. y Garg, N. (2019). SA and AM symbiosis modulate antioxidant defense mechanisms and asada pathway in chickpea genotypes under salt stress. Ecotoxicology and Environmental Safety 178, 66–78. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2019.04.025.
encontraron que con el incremento de las concentraciones de NaCl, se afectó significativamente la producción de biomasa de las plantas de garbanzo, siendo el tratamiento inoculado el que presentó mayores valores en esta variable. Otros trabajos han informado que la exposición del garbanzo a altas concentraciones de salinidad produce severas afectaciones sobre la biomasa de la planta (Sweetman et al., 2020Sweetman, C.; Khassanova, G.; Miller, T. K.; Booth, N. J.; Kurishbayev A.; Jatayev S.; Gupta N. K.; Langridge P.; Jenkin C.L.D.; Soole K. L.; Day D. A. y Shavrukov Y. (2020). Salt-induced expression of intracellular vesicle trafficking genes, CaRab GTP, and their association with Na+ accumulation in leaves of chickpea (Cicer arietinum L.) BMC Plant Biology 2020, 20(Suppl 1):183 https://doi.org/10.1186/s12870-020-023315.
).

Los resultados de este trabajo, se corresponden con los obtenidos por Acosta-MotosAcosta-Motos, J.R.; Ortuño, M.F.; Bernal-Vicente, A.; Diaz-Vivancos, P.; Sanchez-Blanco, M.J.; Hernandez, J.A. Plant Responses to Salt Stress: Adaptive Mechanisms. Agronomy 2017, 7, 18. https://doi.org/10.3390/agronomy7010018.
, et al. (2017), estos autores informaron que una alta concentración salina en las plantas reduce los valores de la tasa de asimilación neta y la relación área foliar, indicando afectaciones sobre la actividad fotosintética, la expansión foliar y los factores de crecimiento.

En la Figura 2, se observa el comportamiento de la colonización micorrízica y la intensidad en raíces de garbanzo sometido a diferentes concentraciones de NaCl hasta los 35 días de germinadas las semillas.

Tanto los valores de la colonización como los de intensidad micorrízica, fueron superiores en las plantas inoculadas con R. irregularis con respecto a las inoculadas con G. cúbense (Figura 2), lo que sugiere la efectividad de inoculación de esta primera cepa para las condiciones de estudio.

A 50 mM de NaCl se observó una disminución de estas variables en las plantas inoculadas con R. irregularis (Figura 2A y B), mientras que las plantas inoculadas con G. cubense, mostraron valores inferiores respecto a R. irregularis, acentuándose esa reducción al incrementarse la concentración de NaCl. No obstante, a concentraciones de 75 mM de NaCl el comportamiento fue distinto, pues la colonización micorrízica disminuyó en los tratamientos con ambas cepas sin diferencias significativas entre ellas (Figura 2A). En el caso de los controles sin inocular, los HMA residentes colonizaron por igual las raíces del garbanzo independientemente del estrés salino aplicado, aunque con valores inferiores al resto de los tratamientos (Figura 2A y B).

Estos resultados son coherentes con otras investigaciones en las que se encontró que el aumento de la concentración de sal en el suelo disminuye gradualmente la colonización micorrízica en la interacción Trigonella foenum-graecum - Rhizophagus intraradices (Evelin et al., 2013Evelin, H.; Giri, B.; Kapoor, R. (2013). Ultrastructural evidence for AMF mediated salt stress mitigation in Trigonella foenum-graecum. Mycorrhiza 23, 71–86. https://doi.org/10.1007/s00572-012-0449-8.
). Así mismo, Hashem et al. (2019)Hashem, A.; Abd_Allah, E.F.; Alqarawi, A.A.; Wirth, S. y Egamberdieva, D. (2019). Comparing symbiotic performance and physiological responses of two soybean cultivars to arbuscular mycorrhizal fungi under salt stress. Saudi J. Biol. Sci. 26, 38–48. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2016.11.015
encontraron, además, que a 100 mM de NaCl, se inhibió la colonización micorrízica en plantas de soya.

Son numerosos los trabajos que demuestran incrementos superiores en la colonización de la raíz, así como en el crecimiento y la productividad de los cultivos, por la inoculación de la cepa INCAM 11 de R. irregularis en suelos con pH superiores a 7 (Simó et al., 2019Simó, J.E.; Rivera-Espinosa, R.; Ruiz-Martínez, L.A.; Díaz-Roche, G. y Ruiz-Sánchez, M. (2019). Effectiveness of arbuscular mycorrhizal fungi inoculated on Canavalia ensiformis L.in Calcaric Histosol soils. Agron. Mesoam. 395–405. https://doi.org/10.15517/am.v30i2.33221
; Simó et al., 2020Simó, J.; Rivera, R.; Ruiz, L. y Martín, G. (2020). The integration of AMF inoculants, Green manure and organo-mineral fertilization, in banana plantations on Calcic Haplic Phaeozems. Tropical and Subtropical Agroecosystems. 23#08. https://doi.org/10.56369/tsaes.2882
; Rivera et al., 2020aRivera, R.; Fernández, F.; Ruíz, L.; González, P.J.; Rodríguez, Y.; Pérez, E., et al. (2020a). Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic® en la producción agrícola. 1st ed. Mayabeque, Cuba: Ediciones INCA. 151 p. ISBN 978-959-7258-05-06.
; Rivera et al., 2020bRivera, R.; Martín, G.M.; Simó, J.E.; Pentón, G.; García-Rubido, M.; Ramírez, J., et al. (2020b). Benefits of joint management of green manure and mycorrhizal inoculants in crop production. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 23(3), Article 97. https://doi.org/10.56369/tsaes.2882
; Rivera et al., 2023Rivera E.; González C.; Ruiz M.; Martín A.; Cabrera R.; (2023). Capítulo 4 Strategic Combination of Mycorrhizal Inoculants, Fertilizers and Green Manures Improve Crop Productivity. Review of Cuban Research. En: New Research on Mycorrhizal Fungus, NOVA Science Publisher. 208 p. https://doi.org/10.52305/GLXN2905
).

En la Figura 3 se muestra el número de esporas de HMA existente en el suelo donde crecieron las plantas de garbanzo. Se apreció correspondencia entre estos resultados y el de las dos variables fúngicas antes descritas (Figura 2), lo cual confirma la efectividad positiva de la inoculación de R. irregularis en relación con G. cubense, resaltando su comportamiento a 50 mM de NaCl.

Se afectó negativamente el número de esporas de las cepas inoculadas al incrementarse la concentración de sal en el suelo. A 75 mM de NaCl no se observó diferencias entre los tratamientos inoculados. Cabe destacar que también se detectaron esporas residentes en el suelo no inoculado, lo cual puede estar relacionado con el comportamiento que se ha venido observando en las plantas sin inoculación.

Estudios realizados por Hashem et al. (2015Hashem, A.; Abd_Allah, E.F.; Alqarawi, A.A.; Aldubise, A. y Egamberdieva, D. (2015). Arbuscular mycorrhizal fungi enhances salinity tolerance of Panicum turgidum Forssk by altering photosynthetic and antioxidant pathways. J. Plant Interact. 10, 230–242. https://doi.org/10.1080/17429145.2015.1052025
) en Panicum turgidum Forssk demostraron que el número de esporas encontradas en el suelo disminuyó significativamente por la salinidad, en concordancia con los resultados obtenidos en este trabajo.

En el presente estudio la mayor colonización micorrízica de las plantas inoculadas con R. irregularis pudiera deberse a un mayor secuestro de Na⁺ en las vacuolas y la retención en el micelio externo, lo que pudiera relacionarse con la efectividad que muestra este hongo en la protección de las plantas de garbanzo ante la toxicidad por Na⁺, lo que se evidencia en los resultados de las variables evaluadas.

Esta respuesta también pudiera estar dada por la adaptación de esta cepa a las condiciones del estudio, resaltando la fertilidad del suelo y su pH, que son factores estrechamente relacionados con el funcionamiento de los HMA, en particular con su establecimiento y eficiencia simbiótica (Rivera et al., 2020aRivera, R.; Fernández, F.; Ruíz, L.; González, P.J.; Rodríguez, Y.; Pérez, E., et al. (2020a). Manejo, integración y beneficios del biofertilizante micorrízico EcoMic® en la producción agrícola. 1st ed. Mayabeque, Cuba: Ediciones INCA. 151 p. ISBN 978-959-7258-05-06.
; Rivera et al., 2020bRivera, R.; Martín, G.M.; Simó, J.E.; Pentón, G.; García-Rubido, M.; Ramírez, J., et al. (2020b). Benefits of joint management of green manure and mycorrhizal inoculants in crop production. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 23(3), Article 97. https://doi.org/10.56369/tsaes.2882
). Los resultados encontrados en la interacción de las plantas de garbanzo cv. ‘N-29’ con las cepas de HMA evaluadas, evidencian que la concentración de NaCl de 25 mM no representó un estrés significativo y que 75 mM resultó un estrés severo para el sistema utilizado.