Introducción

En la naturaleza existe un grupo de microorganismos que estimulan el crecimiento vegetal mediante la activación de distintos mecanismos. Se destacan dentro de ellos, la fijación biológica de nitrógeno atmosférico, la solubilización de nutrientes minerales, la producción de fitohormonas y el efecto contra organismos fitopatógenos. Las bacterias con estas características se conocen como bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB según sus siglas en inglés). Pueden habitar en la rizosfera o en el interior de las plantas y agrupan a géneros como Azotobacter, Azospirillum, Rhizobium, Bacillus, Gluconacetobacter, entre otros (Velasco et al., 2020Velasco, A.; Castellanos, O.; Acevedo, G.; Clarenc, R. y Rodríguez, A. (2020). Bacterias rizosféricas con beneficios potenciales en la agricultura. Terra Latinoamericana. 38: 333-345. https://doi.org/10.28940/terra.v38i2.470.
).

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es una de las leguminosas más valoradas para la alimentación humana por su contenido de proteínas, fibra vegetal, carbohidratos y minerales (Tamayo-Aguilar et al., 2020Tamayo-Aguilar, Y.; Juárez-López, P.; Capdevila-Bueno, W.; Lescaille-Acosta, J. y Terry-Alfonso, E. (2020). Bioproductos en el crecimiento y rendimiento de Phaseolus vulgaris L. var. Delicia 364. Terra Latinoamericana Número Especial. 38-3: 667-678. Disponible en: https://doi.org/10.28940/terra.v38i3.672.
). En Cuba, se realizan grandes esfuerzos para incrementar sus rendimientos, que en los últimos años ha oscilado entre 0,89 y 1 t.ha^-1, siendo insuficiente para cubrir la demanda del grano por parte de la población. La mayor parte de la producción de frijol en el país se desarrolla en el sector no estatal (ONEI, 2021ONEI (2021). Anuario Estadístico de Cuba. 2020. Capítulo 9. Agricultura, Ganadería, Silvicultura y Pesca. 4-35. Oficina Nacional de Estadística e Información. Edición 2021. Disponible en: www.onei.gob.cu.
), en pequeñas fincas ubicadas en zonas periurbanas. Para ello, utilizan sistemas tradicionales de bajos insumos que tienen una alta dependencia de las precipitaciones y presentan dificultades para el riego, por lo que las alternativas que contribuyan a elevar su productividad bajo esas condiciones son de vital importancia.

Para estimular el crecimiento de las leguminosas se utilizan desde el pasado siglo los rizobios, microorganismos que establecen una eficiente asociación con este tipo de plantas. Sin embargo, géneros como Azospirillum, Pseudomonas y Bacillus también pueden asociarse a esos cultivos y contribuir a elevar sus rendimientos, e incluso, ejercer un efecto positivo en el establecimiento y desempeño de la simbiosis Rhizobium-leguminosa (Valero-Valero et al., 2021Valero-Valero, N.O.; Vergel-Castro, C.M.; Ustate, Y. y Gómez-Gómez, L.C. (2021). Bioestimulación de frijol guajiro y su simbiosis con Rhizobium por ácidos húmicos y Bacillus mycoides. Revista Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, 19(2): 119-134. https://doi.org/10.18684/bsaa.v19.n2.2021.1608.
). Con el objetivo de explorar el microbioma asociado al frijol común se realizaron aislamientos de bacterias desde el interior de las plantas, los nódulos y la rizosfera de 10 accesiones y cinco variedades inscritas en Cuba. Además, se determinó, para un grupo de microorganismos seleccionados por sus características morfo-fisiológicas, su potencial para fijar nitrógeno atmosférico, solubilizar nutrientes y tolerar condiciones de estrés abiótico.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

De la rizosfera, los nódulos y el interior de las plantas de las 10 accesiones y las cinco variedades de frijol común que se utilizaron en el estudio se purificaron 140 microorganismos. La mayor contribución en los aislamientos la realizó el ambiente rizosférico, siendo muy similar el porcentaje de microorganismos procedentes del interior de la planta y de los nódulos (Figura 1).

La rizosfera se considera una interface dinámica. Es regulada por la planta y las condiciones ambientales, pero aun así en ella conviven una gran cantidad de microorganismos, por lo que la diversidad filogenética y funcional en este ambiente tiene una alta complejidad (Bonilla et al., 2021Bonilla, R.; González, L.E. y Osvaldo, R. (2021). Bacterias promotoras del crecimiento vegetal en sistemas de agricultura sostenible. Corporación colombiana de investigación agropecuaria – Mosquera (Colombia): AGROSAVIA. Editorial Agrosavia. 327 p. ISBN E-book: 978-958-740-501-9. ISBN: 978-958-740-500-2. https://doi.org/10.21930/agrosavia.analisis.7405019
). Autores como Ahmad et al. (2016)Ahmad, I.; Altaf. M.M.; Sharma, J. y Al-Thubiani, A.S. (2016). Diversity, quorum sensing and plant growth promotion by endophytic diazotrophs associated with sugarcane with special reference to Gluconacetobacter diazotrophicus Chapter 23. En: Plant-Microbe Interaction: An Approach to Sustainable Agriculture. DK Choundrary et al. (eds). Springer Nature Singapore Pte Ltd. 495-509. https://doi.org/10.10.1007/978-981-10-2854_23.
, comentaron en sus estudios que de forma general el interior de las plantas tiene un menor número de microorganismos, debido a la presión selectiva que ejerce el cultivo durante el proceso de colonización. No obstante, se debe señalar que en el caso del presente estudio el aislamiento de un mayor número de bacterias desde la rizosfera de las plantas de frijol también puede estar relacionada con la metodología de trabajo, ya que la cuantificación en este caso se realizó en tres de los cinco medios de cultivo utilizados (Asbhy, Agar Nutriente y NFB), en tanto para el ambiente endófito y los nódulos solamente se utilizó uno (LGI y YMA, respectivamente).

Las accesiones de frijol se destacaron como fuente de procedencia de microorganismos, ya que a excepción de ‘P3697’, de las restantes se purificaron entre 10 y 15 aislados bacterianos, agrupándose en cinco de estos materiales genéticos (‘P3309’, ‘P3609’, ‘P3613’’, P3796’y ‘P3334’) aproximadamente el 50 % de los aislamientos realizados (Figura 2). Estos materiales proceden de fincas de productores de reservas de la biosfera (Sierra del Rosario y Cuchillas del Toa), lugares de referencia como ambientes conservados y donde se promueve la presencia de una alta biodiversidad de plantas que influye también en los microorganismos que a ellas se asocian. Ello puede ser relevante en la selección de nuevas cepas microbianas con alto potencial para la promoción del crecimiento vegetal.

De los 140 microorganismos purificados se seleccionaron 18 que presentaron en los medios de cultivo Asbhy, NFB y YMA características morfológicas similares a las descritas para los géneros Azotobacter, Azospirillum y Rhizobium, respectivamente. La morfología de las colonias, las células y la respuesta a la Tinción de Gram de estas bacterias se muestra en la Tabla 2.

En el interior de las plantas existen diferentes grupos microbianos, aun cuando esta ejerce una presión selectiva en los microorganismos (Rodríguez et al., 2021Rodríguez, C.A.; Ricardo, L.; Pérez, B. y Nelly, Z. (2021). Bacterias y hongos endófitos de la familia Cactaceae y sus aplicaciones. Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 24: 1-14. https://doi.org/10.22201/fesz.23958723e.2021.328.
). Ello explica por qué se aislaron bacterias endófitas en el medio de cultivo LGI que no presentaron las características distintivas del género Gluconacetobacter, específicamente su coloración amarillo intensa-naranja y su respuesta negativa a la tinción de Gram (Cavalcante y Döbereiner, 1988Cavalcante, V.A y Döbereiner, J. (1988). A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugarcane. Plant Soil; 108: 23–31. https://doi.org/10.1007/BF02370096.
), aunque se debe destacar que hasta el momento el frijol común no se refiere dentro de los hospederos de esta bacteria.

Dentro de los nódulos de las leguminosas también se describe la presencia de una comunidad microbiana diversa (Martínez et al., 2020Martínez, V.; Medina, R.; Gauna, J.M. y Balatti, P.A. (2020). Bacterial endophytes diversity of tree legumes from Argentina. Agrociencia Uruguay. Disponible en: http://agrocienciauruguay.uy/ojs/index.php/agrocien-cia/article/view/411.
), con representantes de otros órdenes como Enterobacteriales, Pseudomonales y la subclase β Proteobacteria (Bonilla et al., 2021Bonilla, R.; González, L.E. y Osvaldo, R. (2021). Bacterias promotoras del crecimiento vegetal en sistemas de agricultura sostenible. Corporación colombiana de investigación agropecuaria – Mosquera (Colombia): AGROSAVIA. Editorial Agrosavia. 327 p. ISBN E-book: 978-958-740-501-9. ISBN: 978-958-740-500-2. https://doi.org/10.21930/agrosavia.analisis.7405019
). Ello justifica que de los 24 microorganismos aislados en el medio de cultivo YMA solamente dos presentaron características morfo-fisiológicas similares al género Rhizobium. Los restantes absorbieron el colorante Rojo Congo o fermentaron la lactosa. Este medio de cultivo el género Rhizobium, que agrupa a bacterias Gram negativas, presenta colonias de cremas a traslúcidas, generalmente mucosas, con bordes enteros, elevación que varía de plana a elevada en el medio YMA, que no absorben el Rojo Congo (Alcarraz et al., 2020Alcarraz, M.; González, E. y Heredia, V. (2020). Azotobacter y Rhizobium como biofertilizantes naturales en semillas y plantas de frijol caupí. Avances. 22 (2): 239-251. Disponible en: http://www.ciget.pinar.cu/ojs/index.php/publicaciones/article/view/538/1610
). Este grupo taxonómico presentan las enzimas catalasa y citocromo oxidasa, utiliza el citrato como fuente de carbono, como los dos aislados seleccionados.

De las 29 bacterias aisladas en el medio de cultivo Asbhy se seleccionaron 10, por su morfología. Estas presentaron colonias circulares, con bordes enteros y traslúcidas o beige, con células como bacilos Gram negativos, tal y como describió Alcarraz et al. (2020)Alcarraz, M.; González, E. y Heredia, V. (2020). Azotobacter y Rhizobium como biofertilizantes naturales en semillas y plantas de frijol caupí. Avances. 22 (2): 239-251. Disponible en: http://www.ciget.pinar.cu/ojs/index.php/publicaciones/article/view/538/1610
para el género Azotobacter. Estos aislados presentaron además, una respuesta positiva para las pruebas de oxidasa y catalasa, como en los estudios de Corrales et al. (2020)Corrales, M.; Lumbres, V.; Iglesia, S. y Carreño, C. (2020). Potencialidades de bacterias promotoras del crecimiento vegetal, aisladas de Portulaca oleracea L. en suelos con salinidad. Pastos y Forrajes. 43:93-101. Versión On-line ISSN: 2078-8452.
para cepas de este género bacteriano. Por su parte, de los microorganismos purificados en el medio de cultivo NFB se seleccionaron siete, cuya morfología y fisiología coincidió con las descripciones del género Azospirillum. Según Moreno y Galvis (2020)Moreno, L.Y. y Galvis, F. (2020). Identificación de bacterias diazotróficas rizosféricas y endófitas asociadas a Lycopersicon esculentum Mill en el Norte de Santander, Colombia. Agrociencia, 54 (7): 843-857. ISSN: 2521-9766. Disponible en: http://www.colpos.mx/agrocien/agrociencua.htm.
, esta forma de colonias blancas en el medio NFB, tiene una respuesta positiva a la prueba de la oxidasa, y se distingue por sus colonias rojo escarlata en el medio de cultivo Rojo Congo (Martínez et al., 2006Martínez, V.R; López, M; Brossard, F.M; Tejeda, G.G; Pereira, A.H; Parra, Z.C; Rodríguez, S.J y Alba, A. (2006). Procedimientos para el estudio y fabricación de Biofertilizantes Bacterianos. Ed. INIA - Maracay. Venezuela, Serie B, No. 11. 88 p.
).

En el caso del medio de cultivo Agar Nutriente, que se utilizó con el objetivo de aislar microorganismos con posibilidades de pertenecer al género Bacillus, aunque se logró la purificación de diferentes aislados ninguno formó esporas que le permitieran resistir el procesamiento de la muestra (100 °C de temperatura durante 20 min). Este resultado no es contradictorio, pues en los estudios realizados por Pérez et al. (2020)Pérez, Y.; Rondón, A.J.; Fuentes, L.; Nápoles, M.C.; Martínez, M.M y Rubio, Y. (2020). Rizosfera de tres cultivares de Phaseolus vulgaris L. fuente de bacterias formadoras de endosporas con potencial biotecnológico. Biotecnología Vegetal. 20 (4): 313–325. eISSN 2074-8647, RNPS: 2154. Disponible en: https://revista.ibp.co.cu.
de 437 aislados solamente el 32 % se correspondió con bacilos esporulados Gram positivos, por lo que su proporción no tiene que ser necesariamente tan elevada como para alcanzar siempre resultados positivos en el aislamiento de este tipo de microorganismos.

De forma general, a partir de la siembra de las muestras del interior de las plantas, los nódulos y la rizosfera de diferentes accesiones y variedades comerciales de frijol en diferentes medios de cultivo, se demostró la posible presencia de varios grupos de bacterias con marcadas diferencias morfo-fisiológicas. Tanto el género Rhizobium, como los géneros Azotobacter y Azospirillum se reconocen como promotores del crecimiento vegetal (Velasco et al., 2020Velasco, A.; Castellanos, O.; Acevedo, G.; Clarenc, R. y Rodríguez, A. (2020). Bacterias rizosféricas con beneficios potenciales en la agricultura. Terra Latinoamericana. 38: 333-345. https://doi.org/10.28940/terra.v38i2.470.
), por lo que podrían ejercer un efecto positivo en interacción con el cultivo.

Los 18 microorganismos seleccionados por sus características similares a los géneros Azotobacter, Azospirillum y Rhizobium mostraron diferencias en su potencial como posibles estimuladores del crecimiento vegetal, otro indicador de la diversidad microbiana que se asocia al cultivo del frijol común. Se destacaron como aspectos positivos presentes en todos los aislados la potencialidad para fijar nitrógeno atmosférico, aunque destacó también que cerca del 50 % de ellos toleró condiciones de sequía inducida con PEG 6000 y salinidad (Figura 3), aspecto positivo para su uso en la formulación de nuevos productos que mantengan su efectividad bajo las actuales condiciones de cambio climático.

La Tabla 3 muestra los mecanismos directos de estimulación del crecimiento que presentó cada uno de los aislados. Nótese que todos crecieron en el medio de cultivo carente de nitrógeno combinado, lo cual indica que podrían fijar nitrógeno atmosférico. Sin embargo, ninguno de los microorganismos solubilizó fosfato de hierro o de aluminio. En cuanto a la solubilización de fosfato de calcio se destacaron cuatro aislados, aunque uno de ellos, asociado en el aislamiento del cultivar ‘Wacuto’, fue el único que solubilizó también potasio.

Bonilla et al. (2021)Bonilla, R.; González, L.E. y Osvaldo, R. (2021). Bacterias promotoras del crecimiento vegetal en sistemas de agricultura sostenible. Corporación colombiana de investigación agropecuaria – Mosquera (Colombia): AGROSAVIA. Editorial Agrosavia. 327 p. ISBN E-book: 978-958-740-501-9. ISBN: 978-958-740-500-2. https://doi.org/10.21930/agrosavia.analisis.7405019
destacaron en su revisión el potencial como fijadores de nitrógeno atmosférico de los géneros Rhizobium, Azotobacter y Azospirillum, pues existen referencias del potencial solubilizador de fosfatos de estos géneros bacterianos, aunque se destaca que los resultados dependen de la cepa en estudio, más que del género al cual pertenecen. La solubilización de potasio ha sido menos abordada para las bacterias promotoras del crecimiento. En particular para el género Azospirillum al cual se asoció el aislado F21 por sus características morfo-fisiológicas, no se encontraron referencias sobre este atributo metabólico, por lo que este es un aspecto en el cual se deberá profundizar en estudios posteriores.

Todos los microorganismos crecieron en presencia de un 3 % de NaCl a las 24 h de incubación. Al aumentar la concentración de sal disminuyó el número de aislados con resultados positivos (resultados positivos para 15 aislados para la concentración de 5 % y para tres (F14, F15 y F21) para la concentración de 10 %). Sin embargo, a las 72 h de incubación solamente el aislado F9 no creció a la concentración del 5 %, aspecto que denota que después de un periodo de adaptación todos estos microorganismos toleran la presencia de NaCl. Destacaron los aislados F12, F14 y F15 purificados en el medio de cultivo Asbhy y el F21 procedente del NFB por su tolerancia a la máxima concentración de NaCl utilizada en el estudio desde las 24 h de incubación (Figura 4).

Resultó un aspecto de interés que en los aislados con menor tolerancia al NaCl se modificó la morfología de la colonia al aumentar la concentración de sal, particularmente su consistencia, la que pasó de gomosa a seca (Figura 5). Ello sugiere que la producción de exopolisacáridos podría ser uno de los mecanismos implicados en la tolerancia de las bacterias a esta condición de estrés.

Todos los aislados crecieron en el medio de cultivo con PEG 6000, incluso a la concentración más alta que se utilizó en el estudio (10 %) (Tabla 4). Se destacaron 10 microorganismos que mostraron un crecimiento abundante en presencia de 3 % de PEG 6000, de ellos cuatro aislados en el medio de cultivo Asbhy y los restantes en el medio NFB. Repitieron con resultados relevantes los tres que mostraron mayor tolerancia a condiciones de salinidad (F14, F15 y F21), lo que sugiere que presentan varios mecanismos de adaptación al estrés ambiental.

La adaptación de los microorganismos a condiciones de estrés requiere de la modificación de su metabolismo. Una de las herramientas que utilizan ante estrés de sequía y salinidad es la acumulación de solutos compatibles. Actualmente, una de las estrategias que se proponen para contrarrestar los efectos negativos que provocan estas condiciones de estrés a los cultivos es el uso de microorganismos que, además de adaptarse a estos cambios, estimulen el crecimiento vegetal. Estas bacterias, de forma general, sobreviven tanto a condiciones de sequía como de salinidad, temperaturas extremas y contaminación por metales. En interacción con los cultivos activan mecanismos como la liberación de fitohormonas (en especial ácido indol acético), la síntesis de enzimas como la ACC desaminasa que reduce los niveles de etileno en la planta, regulan la concentración de iones intracelulares y sintetizan solutos compatibles, los que contribuyen a que el vegetal presente una mayor tolerancia al estrés.

El género Azotobacter en particular, se destaca por formar quistes, estructuras que le brindan tolerancia a condiciones ambientales adversas, mientras que para los rizobios, aunque se plantea que tienen susceptibilidad a la salinidad, especies como Rhizobium y Sonirhizobium pueden tolerar altas concentraciones de NaCl, a partir de la acumulación de compuestos como la trealosa y el glutamato (Bonilla et al., 2021Bonilla, R.; González, L.E. y Osvaldo, R. (2021). Bacterias promotoras del crecimiento vegetal en sistemas de agricultura sostenible. Corporación colombiana de investigación agropecuaria – Mosquera (Colombia): AGROSAVIA. Editorial Agrosavia. 327 p. ISBN E-book: 978-958-740-501-9. ISBN: 978-958-740-500-2. https://doi.org/10.21930/agrosavia.analisis.7405019
).

El estudio demostró que la diversidad asociada a las plantas de frijol común no solo está en función de la morfología de los microorganismos, sino de su potencial como estimuladores del crecimiento vegetal y su tolerancia a condiciones de estrés abiótico, por lo que su microbioma constituye un reservorio de agentes potenciales para lograr potenciar el crecimiento y el rendimiento de este cultivo y elevar su productividad en Cuba.

Conclusiones

Asociado al frijol común existe una comunidad microbiana diversa donde se encuentran bacterias similares en morfología a los géneros Azotobacter, Rhizobium y Azospirillum, con características promotoras del crecimiento vegetal y tolerancia a condiciones de estrés abiótico, que podrían constribuir la base de nuevas estrategias para potenciar los rendimientos de esta especie vegetal.

Referencias bibliograficas